中药复方成分复杂、作用靶点多样，明确其关键作用靶点是揭示多成分协同机制、阐释药效物质基础的重要环节。通过靶点鉴定技术，可突破传统候选靶点假设限制，系统挖掘复方中活性成分与靶蛋白的作用关系，为中药现代化研究提供机制依据。

|  复方靶点鉴定方法一：isoTOP-ABPP

isoTOP-ABPP技术基于可结合活性半胱氨酸的DBIA探针，在活细胞中加入中药复方或活性分子与之竞争半胱氨酸结合位点，从而实现药物的靶点筛选鉴定。

研究案例：

中国中医科学院中药研究所研究团队采用isoTOP-ABPP技术筛选蒲地蓝的结合靶点。在炎症诱导的巨噬细胞模型中，共鉴定出了77个高置信度靶点蛋白。其中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）因其在蒲地蓝竞争后显著富集。通过下拉实验、CETSA+WB实验和免疫荧光共定位分析共同证实了蒲地蓝与GAPDH的直接相互作用。进一步通过成分鉴定和功能实验证实了其中显著缓解肺损伤的活性成分。

|  复方靶点鉴定方法二：DARTS+MS

DARTS技术传统用于小分子靶蛋白的鉴定，无需进行样本的结构修饰，可在细胞或组织裂解物种筛选靶点，所以对于中药复方这类复杂样本的靶点筛选尤为有效。

研究案例：

海军军医大学研究团队利用DARTS技术对传统应用于心血管疾病的经典方剂四逆汤（SNT）进行了靶点筛选。通过质谱数据分析，研究者锁定了11个关键靶蛋白。结合前序实验结果与PPI蛋白互作网络分析，蛋白质二硫键异构酶家族的重要成员PDIA3可能是四逆汤保护心肌细胞凋亡的关键靶点蛋白。功能性实验证实，四逆汤在心肌损伤模型中能够显著调控PDIA3及相关靶点。

|  常见问题

Q1：中药复方为什么需要做靶点鉴定？网络药理学预测的靶点不够用吗？

中药复方成分复杂、作用靶点多样，明确关键作用靶点是揭示多成分协同机制、阐释药效物质基础的核心环节。目前大量复方研究依赖网络药理学进行靶点预测——但预测本质上是基于数据库的计算机推断，预测结果动辄数百上千个靶点，真实结合率低，且无法区分"直接作用靶点"与"下游效应蛋白"，这也是高分期刊审稿人对纯网络药理学研究日益严格的原因。实验层面的靶点鉴定技术（如isoTOP-ABPP、DARTS+MS）则能在细胞或组织样本中直接检测药物-蛋白的结合关系，突破传统候选靶点假设限制，系统挖掘复方活性成分与靶蛋白的真实作用网络。理想的证据结构是"预测+实验验证"：网络药理学提供假设，实验鉴定提供证据，两者结合的中药作用机制研究才是当前的主流范式。

Q2：达吉特用哪些技术做复方靶点鉴定？各有什么特点？

达吉特针对中药/复方等复杂分子体系，建立了两种互补的无偏向靶点筛选技术：第一种是isoTOP-ABPP技术——基于可结合活性半胱氨酸的DBIA探针，在活细胞中加入中药复方或活性分子与之竞争半胱氨酸结合位点，实现靶点的高通量筛选鉴定，其最大优势是"活细胞内"进行，能真实反映复杂生物环境中的作用靶点，且通量高（可经TMT标记实现多样本并行检测）；第二种是DARTS+MS技术——利用"药物结合后靶蛋白酶解稳定性增强"的原理，无需对样品进行任何结构修饰，直接在细胞或组织裂解液中筛选靶点，操作简便、适用性广，对中药复方这类组成复杂的样品尤为友好。两种技术可以单独使用，也可以联合应用、互相印证，结合达吉特的高标准成分鉴定，还能进一步关联候选靶点与具体活性化合物，形成"成分-靶点"对应的完整研究结论。

Q3：什么是isoTOP-ABPP？它和普通ABPP有什么区别？

ABPP（Activity-Based Protein Profiling，基于活性的蛋白质组分析）是利用活性探针检测蛋白功能状态的技术，而isoTOP-ABPP（isotopic Tandem Orthogonal Proteolysis-ABPP）是其升级版，专门用于竞争性靶点发现。其工作原理是：设计一种带有同位素标签的可与蛋白活性半胱氨酸（Cys）反应的DBIA探针——如果某个蛋白的半胱氨酸位点被药物分子占据，探针就无法标记该位点；通过对比"给药组"与"对照组"的探针标记强度差异，就能反推出哪些蛋白的哪些位点被药物结合，实现从"蛋白"到"位点"的精细化鉴定。相比普通ABPP，isoTOP-ABPP的位点分辨率更高（能定位到具体半胱氨酸残基，如蒲地蓝研究中的GAPDH Cys150）、通量更大（TMT多通道标记）、定量更准确。对含亲电结构或能与半胱氨酸可逆/不可逆结合的中药活性分子（如黄酮类、醌类化合物），isoTOP-ABPP是揭示其直接作用靶点的利器。

Q4：DARTS技术的原理是什么？为什么它特别适合中药复方样品？

DARTS（Drug Affinity Responsive Target Stability，药物亲和反应靶向稳定性）基于一个简洁而巧妙的原理：当小分子药物与靶蛋白结合后，会增强靶蛋白的空间结构稳定性，使其更能抵抗蛋白酶的酶解——也就是说，"被药物保护的蛋白"在蛋白酶作用下降解得更慢。实验中只需将药物与细胞/组织裂解液共孵育，再用蛋白酶（如嗜热菌蛋白酶）梯度酶解，通过质谱检测各蛋白的酶解残留差异，结合药物处理的蛋白即为候选靶点。DARTS对中药复方样品尤其友好的原因有三：一是无需对小分子做任何化学修饰（复方是混合物，逐一修饰根本不可行），完全的非标记策略；二是直接使用裂解液体系，操作简便、重现性好；三是可适用于大多数小分子化合物，普适性强。海军军医大学团队正是用DARTS技术从经典方剂四逆汤中锁定了11个关键靶蛋白，并锁定PDIA3为保护心肌细胞的关键靶点。

Q5：靶点鉴定实验用细胞做还是用组织做？样本如何选择？

这取决于研究目标与药物作用场景：isoTOP-ABPP在活细胞中进行，优势是保留了完整的细胞环境与蛋白天然构象，适合观察药物在生理状态下的靶点占用情况，推荐用于机制研究的主实验；DARTS则灵活得多，细胞裂解液与组织裂解液都适用——如果您想直接分析给药动物病灶组织的靶点结合情况（临床转化价值更高），DARTS+组织裂解液是理想选择。样本选择上还有两个实用建议：一是模型选择要贴合疾病机制，如蒲地蓝研究选用LPS诱导的巨噬细胞炎症模型，确保筛选背景与药效场景一致；二是对照组设计要严谨，给药组与对照组的细胞状态、裂解条件需严格平行，才能把差异信号归因于药物结合。达吉特技术团队会在方案设计阶段协助您优化模型与分组，确保筛选结果既科学又有故事性。

|  参考文献

1. Li X, Qin L, Sun Y, et al. Qingyu Yangjing formula ameliorates cyclophosphamide-induced oligoasthenospermia by regulating the hypothalamic-pituitary-gonadal axis and inhibiting testicular oxidative stress and apoptosis in rats. J Ethnopharmacol. 2026;356:120842. doi:10.1016/j.jep.2025.120842

2. Zhang D, Zhang J, Chen S, et al. An integrated approach for studying exposure, metabolism, and disposition of traditional Chinese medicine using PATBS and MDRB tools: a case study of semen Armeniacae Amarum. Chin Med. 2024;19 (1):158. Published 2024 Nov 14. doi:10.1186/s13020-024-01031-8

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