短梯度（10-20min）： 峰容量极低，导致大量成分堆叠（叠峰），高强度信号会掩盖低丰度活性成分，且无法区分同分异构体。

长梯度（40-60min）： 能有效拉开不同极性的物质，提升分离度，是实现高准确率定性的基础。

常用数据库分为三类：第一类是不分来源的通用库，干扰性较大；第二类是基于文献整理的库，虽排除了非中药成分，但因仪器不同导致保留时间（RT）无法匹配；第三类是实物标准品库，所有标准品在同一台质谱仪上测定，保留时间恒定，鉴定准确率可达95%。

中药中的小分子存在成分复杂、含量低、同分异构体多等特点，对其鉴定存在非常大的困难，标准品及标准品库的建设能力一定程度制约了中药小分子成分鉴定的数量及准确性。根据《2020 版中国药典》中收录的所有中药，我们对其多达 5000+种中药小分子成分：如黄酮类、皂苷类、生物碱类、有机酸类、苯丙素类等标准品，用同一台质谱仪进行碎裂和鉴定，收载了超过 20000 张高分辨的准确质量二级质谱图谱，所有图谱中的碎片信息再经过严格的验证流程进行质量校正，建立了中药小分子标准品质谱离子谱图库。该谱图库为中药乃至中药复方有效成分的解析垫定了坚实的基础。

成分鉴定属于定性实验（确认存在与否），通常不需要生物学重复。建议将同一时间点多只动物的血液合并为一个样本，以汇集低丰度信号，提升鉴定数量。

设置末次给药后不同的时间点采集血样或组织样本，这是因为药物进入到血液或组织中有快有慢，发生代谢的速度也有快有慢，所以为了尽可能地把所有能够进入到血液或组织中的成分及其生成的代谢产物鉴定出来，需要采集不用时间点的样本进行检测。但是因为我们的入血入组织分析只是定性分析，重点在于分析哪些成分能够进入血液或组织，转化成了哪些代谢产物，因此需要对给药后不同时间点的样本做混样检测。

（1）对于原型成分，将原方鉴定出来的所有成分都在给药组生物样本鉴定结果中提取对应的分子式、分子量，保证原型成分鉴定是没有遗漏的；

（2）对于代谢产物成分，根据I相、II相代谢途径规律及文献报道，将原方成分可能发生的代谢产物，都进行判断并列出。将分析得到的所有潜在代谢产物对应的分子式、分子量都在给药组生物样本的鉴定数据中进行搜索提取。若有二级碎片，再通过裂解规律确定是否符合母核结构，保证代谢产物尽可能多的鉴定出来。

（3）之后，在空白组生物样本中对上述所有鉴定到的原型成分和代谢产物进行搜索。若某成分在空白组中也存在，则判定其为生物样本中的内源性物质并予以剔除；保留仅在给药组中出现的成分，确认为复方入血/入组织的原型成分或其外源性代谢产物。该流程即通过空白组扣除生物样本中的内源性干。

• TIC（总离子流图）： 所有离子强度加和，反映样品的总体复杂度和含量。

• BPI（基峰图）： 仅显示每个时间点最强离子的强度，图谱更清晰，背景噪音低。

• EIC（提取离子图）： 仅追踪特定质荷比（m/z）的信号，用于目标化合物的检测与定量。

传统的Pull-down、ABPP等钓靶技术通常在细胞或组织裂解液中进行，小分子极易富集到复杂的间接结合蛋白复合物，给后续的验证和假阳性排除带来极大的干扰，研究者难以断定谁才是真正的直接结合受体 。而20K人类蛋白芯片上的每种重组蛋白均是以独立、纯化的形式点制并固定在芯片表面 。由于没有复杂的细胞内级联反应和蛋白多聚体干扰，荧光信号直接代表了小分子与单一纯化蛋白之间的直接物理结合，从原理上规避了间接结合信号的干扰，为后续的功能验证提供了高信度的起点。

细胞内天然蛋白的丰度差异极大，低丰度或瞬时结合的蛋白（如许多转录因子、修饰酶等）在细胞裂解液中的浓度微乎其微，在传统的质谱分析中极易被高丰度蛋白信号掩盖或在洗脱中丢失。而20K人类蛋白组芯片上的每种蛋白质都是经过体外真核系统表达纯化后再点制的，在芯片点上的浓度和纯度较高。这种高丰度、高密度的重组蛋白排布，能够提供足够的特异性结合位点，从而灵敏地捕获到那些相互作用较弱、解离较快或结合时间极短的瞬时相互作用信号，大幅降低了低丰度靶点的漏检率。

天然产物和小分子中药单体往往具有极其复杂的“一药多靶、一药多效”调控特点，如果采用常规手段逐个猜测并验证靶点，时间成本和科研经费投入将极其庞大。20K芯片只需极微量（微克级）的小分子样品，即可在单次实验中实现两万余种人源蛋白的无偏见扫描 。它不仅能帮助科研人员在一系列未知候选物中高效鉴定出真实的物理结合靶蛋白，其产出的一份“全景靶点图谱”还可为后续不同疾病方向的持续挖掘提供丰富的“靶点资源池”。这种“一次投入，多点突破，数据可反复开发”的科研产出模式，使其性价比优势显著。

理想的研究闭环需要将组学的“广度”与芯片直接筛靶的“精度”进行有机协同，把“起因”与“结果”有机地穿插起来：

（1）组学提供“战场轮廓”： 通过多组学研究发现药物处理后差异调控的通路，比如激活了脂肪酸氧化或抑制了某类转录因子；

（2）20K人类蛋白组芯片寻找“始发扳机”： 利用20K芯片无偏筛选出小分子的直接物理结合靶标，排除大量下游次级改变的假靶标干扰；

（3）建立因果关联： 验证20K芯片筛到的直接靶标是否确实调控组学中发现的那条差异通路，例如证实靶蛋白结合后会促进通路中转录因子的入核活化；

（4）功能确证： 通过基因敲除阻断该直接靶点，证明此时药物无法激活组学发现的下游通路且药效表型消失，从而建立起“药物 -> 直接靶点 -> 通路调控 -> 组学表现 -> 表型好转”的因果关系链条，通过这一研究路径可高效发表高水平学术论著。