中药复方作为中医药理论的重要载体和中医临床治疗的主要形式手段，其研究核心在于破解“多成分-多靶点-整体调控”的科学内涵，但长期以来面临着“物质组成难鉴别、靶点机制难明确”的困境。传统复方通常由数十甚至上百种成分组成，传统研究思路需先明确其化学成分组成（物质基础），再阐明其分子调控网络（作用机制），这两部分相辅相成缺一不可。

在过去为主流的网络药理学与组学手段虽能提供复方的机制线索，但更多的是药效相关性研究，难以满足现今对于“精准阐明调控机制”的更高要求。依赖数据库分析的预测手段和多为效应蛋白解析的组学手段，难以直接鉴别被复方成分直接调控的“关键靶点”，导致大多数研究成果仍然停留于“功能现象描述”层面。然而，随着技术手段的飞速发展和众多研究者的深入探究，目前已有两大策略能够帮助中药复方突破复杂小分子群靶点发现的困境。

技术原理：在ABPP的基础上，利用碘乙酰胺的炔基衍生化广谱探针针对蛋白质组中的反应性半胱氨酸基团，从而筛选药物结合靶点蛋白的技术应运而生——基于同位素标记串联正交酶水解的活性蛋白质分析技术（isoTOP-ABPP）。

广谱探针（脱硫生物素-碘乙酰胺探针，DBIA probe）可结合/标记带有活性半胱氨酸或其他活性氨基酸的蛋白组；细胞中加入活性分子孵育后，活性分子与靶点蛋白共价或非共价结合，结合后通过共价/非共价位阻/变构等因素，将干扰广谱探针与活性分子靶蛋白的结合，在质谱中可定量测定到对照组与活性分子组发生较明显比例变化的蛋白或位点，从而确定活性分子的靶点蛋白。

研究案例：2025年12月，中国中医科学院中药研究所王继刚教授团队在《Phytomedicine》发表了题为“Covalent Targeting GAPDH by Pudilan Formula and Baicalein Suppresses Macrophage Warburg Effect to Alleviate Acute Lung Injury”的研究文章。研究团队利用isoTOP-ABPP技术筛选了经典中成药蒲地炎消炎制剂的作用靶点，并进一步通过成分鉴定和功能实验证实了其中显著缓解肺损伤的活性成分。

研究者首先通过体外细胞实验证实了蒲地蓝减轻活化巨噬细胞炎症反应的抗炎作用（图1A）。随后，为阐明其抗炎机制，采用isoTOP-ABPP技术筛选蒲地蓝的结合靶点（图1B）。在炎症诱导的巨噬细胞模型中，共鉴定出了77个高置信度靶点蛋白，其中，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）因其在蒲地蓝竞争后显著富集，被作者认为是主要的候选靶点（图1C-D）。PPI网络分析及KEGG富集分析结果显示，蒲地蓝的作用靶点主要集中于代谢相关通路，再次证实GAPDH是一个功能相关的潜在靶点（图1E）。

图1  利用isoTOP-ABPP技术鉴定蒲地蓝的潜在抗炎靶点

为了验证这一猜想，研究者通过下拉实验、CETSA+WB实验和免疫荧光共定位分析共同证实了蒲地蓝与GAPDH的直接相互作用（图2A-C）。此外，研究者还进一步利用纯化的GAPDH蛋白用于isoTOP-ABPP实验，以寻找具体的结合位点。实验结果显示，蒲地蓝能够共价修饰GAPDH的Cys150位点，并抑制其酶活性，从而抑制巨噬细胞炎症反应（图2D-F）。

图2  蒲地蓝与GAPDH Cys150共价结合并抑制其酶活性

由于多组分的中药制剂固有的复杂性，所以阐明其作用机制也是研究中的重大挑战。由此，研究者通过高分辨质谱分析了蒲地蓝的化学组成，鉴定到了五种主要的活性分子（黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、咖啡酸）（图3A）。进一步，通过功能实验证实，黄芩素具有最为显著的抗炎功效，证实了黄芩素是蒲地蓝中最主要的生物活性成分（图3B-C）。此外，竞争性标记实验、下拉实验和酶活等测试结果表明，黄芩素能够与GAPDH直接结合并抑制其酶活性，证实黄芩素是蒲地蓝中通过共价靶向并抑制GAPDH，发挥抗炎作用的关键分子（图3D-E）。

图3  蒲地蓝中的黄芩素是发挥抗炎作用的关键活性成分

最后，研究者揭示了其发挥作用的核心机制：黄芩素共价靶向GAPDH Cys150，抑制其酶活性，从而破坏活化巨噬细胞中的Warburg效应，重编程细胞代谢，最终逆转促炎M1极化并抑制炎症介质的产生（图4）。

图4  黄芩素的作用机制

研究总结：本研究利用isoTOP-ABPP技术首次精准发现了中药复方蒲地蓝的直接靶蛋白并明确了其共价结合位点。同时，通过复方成分鉴定解析其物质组成，进一步克服了中药“多组分、多靶点”研究中的靶点模糊与活性物质模糊的难题。此外，成功示范了isoTOP-ABPP技术这一新型筛靶利器在中药现代化研究中的强大应用潜力，为解析其他中药复方提供了可借鉴的技术路线。

isoTOP-ABPP技术为中药复方的靶点鉴定提供了高质量、高特异性的解决方案。不过，这项技术依赖竞争性结合原理，对整体实验设计和流程把控以及质谱检测的灵敏度要求较高，技术门槛相对较高，且在研究中需重点关注“共价结合”这一特定互作类型。若研究者并非主要关注共价结合或希望以更低的技术复杂度实现靶点初筛，此时DARTS+MS技术便展现其具普适性、兼顾实用性与性价比的特点。  

技术原理：药物亲和反应靶向稳定性技术（DARTS）是基于蛋白的酶解稳定性原理，即药物和靶点蛋白结合后会使蛋白结构发生变化，从而增强蛋白对广谱蛋白酶的耐受能力或敏感性，进一步通过质谱鉴定在对照组和给药组中差异表达蛋白，即药物的潜在结合靶蛋白。

研究案例：2025年8月，海军军医大学研究团队在《Chinese Journal of Natural Medicines》发表了题为“Combining label-free quantitative proteomics and 2D-DIGE to identify the potential targets of Sini Decoction acting on myocardial infarction”的研究文章。研究团队利用DARTS技术对传统应用于心血管疾病的经典方剂四逆汤（SNT）进行了靶点筛选，为四逆汤应用于心肌梗死治疗提供了重要的数据基础。

研究团队基于大鼠心肌梗死模型证实了四逆汤对于心肌细胞的保护作用，并揭示了其对于急慢性心肌梗死的治疗潜力（图5A）。随后，采用蛋白组学筛选四逆汤在大鼠组织中所调控的差异蛋白与其功能调控。结果发现，四逆汤能够显著调控80余种蛋白的差异表达，这些差异蛋白的功能主要涉及脂肪酸分解代谢、肌动蛋白丝组织和脂肪酸β-氧化等（图5B-C）。

图5  四逆汤的心肌保护作用验证与作用机制探索

为了阐释清楚四逆汤的具体机制调控网络，研究者采用DARTS+MS技术筛选四逆汤的靶点蛋白。通过质谱数据分析，研究者锁定了11个关键靶蛋白（图6A）。结合前序实验结果与PPI蛋白互作网络分析，蛋白质二硫键异构酶家族的重要成员PDIA3（蛋白二硫键异构酶A3）可能是四逆汤保护心肌细胞凋亡的关键靶点蛋白（图6B-C）。最后，功能性实验证实，四逆汤在心肌损伤模型中能够显著调控PDIA3及相关靶点，但是还需进一步确认四逆汤中活性化合物与这些靶点的结合与功能调控效果。

图6  DARTS技术鉴定四逆汤的潜在作用靶点

研究总结：DARTS方法最初用于鉴定小分子化合物的靶点蛋白，其优势在于无需进行结构修饰，能够在细胞或组织中筛选药物的结合靶点，所以对于中药复方这种复杂体系的靶点筛选尤为有效。该研究为阐明中药复方作用机制研究提供了一个非常好的基础范本。未来，随着靶点验证与临床实验的逐步推进，中药复方也能逐渐从“经验用药”向“精准用药”实现成功转型。

达吉特评述

中药复方的现代化研究始终面临着“成分复杂、机制模糊”的核心困境，随着研究的深入推进，不仅需要完成中药复方成分的精准鉴定，更为关键的是明确作用靶点，搭建“成分-靶点-功能”的精准关联。过去的手段无法满足现代研究的目的需求，发现中药复方作用的上游直接结合靶点，才是突破机制研究“黑箱”的关键一步。

本文介绍的两项技术DARTS、isoTOP-ABPP现已成为鉴定中药复方结合靶点的关键手段。DARTS凭借其无需标记和药物结合后蛋白对蛋白酶水解抗性差异的原理，最大程度保留了复方成分与靶点蛋白的相互作用信息；isoTOP-ABPP技术则利用复方成分与广谱探针的竞争作用，特异性捕获并定量结合靶点，还能够利用重组蛋白进一步鉴定结合位点。这两种技术不仅突破了传统预测和组学手段的局限，更从分子水平上捕获直接作用靶点，明确核心调控分子和通路，是连接复方成分与药理效应的核心桥梁，也是推动中药复方研究从“表型关联”向“分子机制精准阐释”转变的核心支撑。

无论是高标准的中药复方成分鉴定还是用于复方筛靶的DARTS、isoTOP-ABPP技术，达吉特均建立了成熟的技术体系，能够提供高质量高标准的技术服务，并拥有丰富的项目经验，帮助广大研究者推动中药复方现代化进程。

达吉特针对中药及小分子药物研究，建立了一套完整的技术服务体系：