共价结合化合物在靶点结合稳定性上远超非共价化合物，具备减少用药剂量、降低用药频次，拓宽用药窗口等显著优势，一直是药物研发的热点候选分子。天然产物及中药单体具有结构多样性与生物活性多重性的特点，是共价药物发现的宝库。

特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性、进展性、纤维化性间质性肺病。目前，FDA批准用于IPF的两种药物（吡非尼酮和尼达尼布）主要作用是延缓疾病进展，但其作用有限的同时存在一定副作用。近期的研究表明，衰老细胞的积累及其分泌的衰老相关分泌表型（SASP）有助于IPF的发病机制。

2025年12月12日，中国中医科学院中药研究所王继刚教授团队在《Exploration》（IF=22.5）发表了题为“Caffeic Acid Acts as a Potent Senomorphic and Alleviates Inflammation and Lung Fibrosis by Covalently Targeting Annexin A5 Protein in Mice”的研究论文。本研究筛选发现了具有抗衰老潜力的天然产物咖啡酸（CA）。进一步通过isoTOP-ABPP技术在细胞中筛选鉴定了CA的共价靶标是膜联蛋白A5（Annexin A5，ANXA5），CA与ANXA5的Cys316位点结合，诱导其降解并抑制NF-κB炎症通路的活化，最终有效缓解肺纤维化。该研究为开发新的IPF药物提供了先导化合物、潜在蛋白靶点以及完备的药效和药理证据。

研究者在衰老细胞模型中筛选了30种天然产物，结果显示，咖啡酸（CA）能够有效抑制代表性炎性因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的含量，并以剂量依赖性地抑制SASP分泌，证实了CA是一种有效的抗衰老候选分子（图1A-C）。

图1  基于细胞模型筛选药物，发现抗衰老天然产物咖啡酸

为了探究CA作为抗衰老分子的作用机制，研究者对衰老细胞中CA的靶点蛋白进行了全面筛选。CA的化学结构具有典型的不饱和酮基团，可能与蛋白质中半胱氨酸残基的巯基发生共价反应。因此，研究者采用了可靶向结合半胱氨酸位点的广谱探针（去硫代生物素碘乙酰胺探针DBIA），进行竞争性活性蛋白质分析技术（isoTOP-ABPP）筛选其可能发挥共价结合作用的靶点蛋白（图2A）。

研究结果显示，CA能够有效竞争DBIA探针结合的靶点蛋白，证实了研究者的推断。最终，研究者生成了一个CA潜在结合的半胱氨酸组数据集，其中竞争比率排名最高的是ANXA5-Cys316（图2B-D）。进一步的探针下拉实验等也证实了CA与ANXA5的相互作用（图2E）。

图2  isoTOP-ABPP技术筛选验证咖啡酸共价靶向ANXA5

最后，研究者在衰老细胞模型和博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中证实了CA对于衰老表型和肺纤维化的抑制作用。机制研究发现，CA与ANXA5的共价结合导致其疏水内核暴露，引发ANXA5蛋白降解，从而抑制PKCθ和NF-κB炎症信号通路，最终发挥抑制SASP分泌和抗肺纤维化的作用（图3A-D）。

图3  咖啡酸靶向ANXA5抑制炎症信号转导

总结与讨论

共价化合物是指通过功能性反应基团与靶点蛋白的特定氨基酸残基形成不可逆的共价键，从而持久调控靶蛋白的活性或生物学功能的化合物。在众多可发生共价结合的氨基酸中，半胱氨酸（Cys）因侧链巯基（-SH）具有极强的亲核性，且在蛋白功能结构域中分布广泛，成为共价化合物最主要的作用靶点。isoTOP-ABPP技术基于能够靶向结合半胱氨酸的广谱探针，利用竞争性ABPP技术流程原理，高效地发现共价化合物的潜在半胱氨酸结合位点。利用该技术不仅能够筛选发现药物结合靶点，也为共价药物的作用机制研究和未来新药设计提供了关键数据基础和研究方向。

isoTOP-ABPP技术的出现，为活性小分子的共价靶标筛选乃至半胱氨酸结合位点的鉴定，都提供了高效且可靠的解决方案。

在先前的文章中，达吉特已对isoTOP-ABPP技术的具体原理、流程和应用案例进行了梳理介绍，可供大家进行参考：

1.3篇Cell，2篇Nature，1篇Science： isoTOP-ABPP凭实力成为最易登上CNS的钓靶技术

2.王继刚团队揭示新藤黄酸通过阻断HK1介导的Warburg效应与NLRP3炎性小体激活从而改善脓毒症

近20年，ABPP技术发展出了很多衍生技术，在小分子靶点发现、活性化合物筛选和先导化合物结构优化等方面均发挥了重要作用。目前5种主流ABPP衍生技术的应用成果均在CNS正刊上发表，达吉特均建立了成熟的技术路线，可以提供高质量的技术服务，并拥有丰富的项目经验，具体如下表：

同时，达吉特已经合成了数百种炔基和光交联基团标记的小分子，可以支持研究人员在各类细胞中利用不同ABPP技术快速钓取疾病相关特异性功能靶点或针对特定靶点进行活性分子筛选。

具体分子列表请见官网：www.tgtmed.com

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