研究团队针对ERAD表型构建了1536孔板高内涵筛选体系。该系统通过监测NHK（ER腔内误折叠蛋白）和CD36（ER膜蛋白）从ER到胞质的易位过程，实时量化ERAD活性（图1A）。以硼替佐米为中性对照、p97抑制剂NMS-873为阳性对照，筛选96,047个化合物后获得956个初筛阳性化合物（图1B-C）。经药效浓度依赖性验证、二级CD36-drGFP确认及细胞毒性检测流程，最终锁定了候选小分子225（图1D）。功能验证显示，225 呈剂量依赖性抑制 ERAD 底物的逆向转运，IC50 低至 1.02 μM，可显著阻断错误折叠蛋白的泛素化与降解，并稳定 ΔF508CFTR 蛋白，是高特异性、高活性的全新 ERAD 抑制剂。

225处理HeLa细胞后，剂量和时间依赖性地显著下调ERAD核心组分HERP1、OS9和FAM8A1蛋白水平，同时伴随PERK磷酸化迁移（图2A）。蛋白酶体抑制剂可阻断这一降解，而溶酶体抑制剂与p97/VCP抑制剂无效，表明225诱导的降解依赖蛋白酶体与ERAD途径。转录组GSEA分析显示UPR通路显著富集，其中PERK激活最为突出。PERK抑制剂能够部分缓解225诱导的细胞死亡（图2B-C）。这些数据表明，225通过抑制ERAD易位，触发ERAD复合物关键蛋白的降解，并激活PERK介导的促凋亡信号。

为揭示225的分子靶点，研究者合成了光亲和探针225-cc。证实该探针保留ERAD抑制活性后，利用ABPP技术筛选鉴定225-cc的靶点蛋白（图3A）。结果显示，225的结合靶点并非传统的ERAD组分，而是线粒体外模上的电压依赖性阴离子通道蛋白VDAC1、VDAC2和VDAC3三种亚型（图3B-C）。经MST、CETSA+WB及VDAC敲除实验多维度验证了225与VDAC的直接结合及其功能调控作用（图3D-F）。

机制研究发现，225结合VDAC后，后引发了胞质、线粒体及内质网内的钙离子水平显著上升。这种钙稳态的破坏触发了PERK-STIM1信号轴的激活，进而驱动HERP1、OS9和FAM8A1等ERAD核心组分发生选择性降解（图4A-C）。而该过程形成正反馈环路，在敏感癌细胞中持续抑制 ERAD 功能、激活促凋亡 UPR 信号，在正常成纤维细胞中却未观察到类似效应，体现了小分子225的肿瘤选择性。体内实验结果也进一步证实，225是兼具安全性与有效性的全新抗癌先导化合物（图4D-E）。

总结与讨论

本研究通过高内涵筛选结合光亲和ABPP靶点鉴定，从药物筛选到机制探索，系统阐明了小分子225靶向VDAC诱导钙稳态失衡、破坏ERAD并选择性杀伤癌细胞的完整机制。在当代新药发现中，高内涵筛选系统能够超越传统的单一维度检测，在活细胞中通过对细胞形态、蛋白定位及细胞器功能等多维度参数的同步监测，实现对海量活性分子的精准评价。而光亲和ABPP技术作为靶点鉴定领域的“前沿利器”，能够在活细胞原位环境中实现药物靶点的全面捕捉，为活性分子的机制解析提供可靠的靶点证据。

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2) 空间药物分布与空间代谢组

3) 小分子化合物批量标记（生物素/炔基/荧光）

4) 小分子钓靶（标记法）：20K人类蛋白组芯片/ ABPP/竞争性化学蛋白组

5) 小分子钓靶（非标记法）：DARTS /Lip-MS/ CETSA

6) 膜蛋白靶点筛选技术：SPIDER / MPA/GPCR膜蛋白芯片

7) 药物调控通路筛选：磷酸化抗体芯片/磷酸化蛋白组

8) SPR表面等离子共振（分子动力学）

9) 药-靶结合位点分析：HDX氢氘交换质谱、共价结合位点质谱

10) 高通量筛药：类器官筛药、高内涵筛药、GPCR抑制剂/激动剂筛选

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