为探究绿原酸对肝再生的作用，研究者构建了90%及70%肝部分切除术（PHx）小鼠模型进行体内实验。结果显示，绿原酸能够显著提高模型小鼠的生存率、升高肝脏指数、增加肝细胞有丝分裂及BrdU、Ki-67阳性细胞比例，并上调细胞周期关键蛋白的表达（图1A-C）。这些结果证实，绿原酸能够有效加速肝细胞周期进程，促进肝部分切除术后的肝脏再生。

为揭示绿原酸发挥作用的分子机制，研究者基于GEO数据库进行分析。结合实验结果，绿原酸虽不改变Nrf2的mRNA表达，但显著增强了其在术后降低的核转位情况，并激活下游抗氧化应答（图2A-C）。为验证这一发现，研究者构建了Nrf2敲除小鼠，结果显示，在Nrf2缺失的情况下，绿原酸原本增加肝脏指数、促进细胞增殖的作用消失（图2D）。结果证实，Nrf2是介导绿原酸促进肝脏再生的关键。

基于上述实验结果，研究者进一步探究了Nrf2对肝细胞周期及能量代谢的调控作用。结果显示，绿原酸可通过Nrf2依赖性途径上调E2F1的mRNA表达，促进细胞周期相关蛋白表达以加速肝细胞周期进程（图3A-C）；同时，绿原酸可通过Nrf2依赖性途径上调Ppargc1a的mRNA表达，激活PPARα介导的脂肪酸β-氧化，增强 ATP生成以支撑细胞周期进程。在Nrf2敲除小鼠模型中的实验结果也验证了这一发现（图3D-F）。这些结果证实，绿原酸通过Nrf2依赖性途径双重调控肝细胞周期与能量代谢，为肝脏再生提供保障。

为进一步阐明绿原酸激活Nrf2的分子机制，研究者采用生物素标记的绿原酸（Biotin-CGA）开展20K人类蛋白组芯片（HuProt 蛋白微阵列）实验，系统筛选绿原酸的直接靶点。芯片筛选结果中，Keap1被研究者锚定为绿原酸的直接结合候选靶点（图4A）。Pull-down/CETSA+WB、MST、分子对接及分子动力学模拟等实验进一步证实，绿原酸可直接与Keap1结合（图4B-C）。功能验证层面，研究者通过构建肝脏特异性Keap1敲除小鼠模型，证实 Keap1/Nrf2 信号通路是介导绿原酸发挥促肝脏再生作用的关键通路（图4D-E）。此外，经分子对接、突变与细胞实验证实，Keap1 Kelch结构域的Arg415残基是绿原酸与 Keap1结合的关键位点（图4F）。

总结与讨论

在众多靶点筛选技术中，20K人类蛋白组芯片是唯一能够做到筛选到的靶点都是直接靶点的技术，该技术的应用极大地降低了研究人员筛靶后验证工作的难度，缩短了整体研究的周期，对于功能已经明确的药物分子，在深入药理研究的第一步，利用20K人类蛋白组芯片进行直接靶点的广泛筛选实为明智之举。

达吉特针对中药及小分子药物研究，建立了一套完整的技术服务体系：

1) 中药/复方的有效成分高标准鉴定/活性成分定量

2) 空间药物分布与空间代谢组

3) 小分子化合物批量标记（生物素/炔基/荧光）

4) 小分子钓靶（标记法）：20K人类蛋白组芯片/ ABPP/竞争性化学蛋白组

5) 小分子钓靶（非标记法）：DARTS /Lip-MS/ CETSA

6) 膜蛋白靶点筛选技术：SPIDER / MPA/GPCR膜蛋白芯片

7) 药物调控通路筛选：磷酸化抗体芯片/磷酸化蛋白组

8) SPR表面等离子共振（分子动力学）

9) 药-靶结合位点分析：HDX氢氘交换质谱、共价结合位点质谱

10) 高通量筛药：类器官筛药、高内涵筛药、GPCR抑制剂/激动剂筛选

11) 以靶找药：虚拟筛选+HSPR筛化合物库、SPR筛中药活性成分

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