| 半胱氨酸位点的重要性

蛋白组中关键的氨基酸位点：在蛋白质组中，半胱氨酸是亲核性最强的氨基酸之一。其侧链巯基具有较高的亲核性与氧化还原敏感性，既可作为多种酶的催化亲核试剂，也参与变构调控、金属配位与氧化修饰。正因这种高反应性，半胱氨酸成为共价药物设计中常见的结合位点，也使"在细胞层面定位小分子结合的半胱氨酸"成为靶点发现与机制研究中的关键环节。

| isoTOP-ABPP的发展和技术原理

isoTOP-ABPP技术发明：2010年，来自斯克利普斯研究所的Benjamin F. Cravatt研究团队于《Nature》发表了一项题为“Quantitative reactivity profiling predicts functional cysteines in proteomes”的研究。该研究在ABPP技术的基础上开发了一种竞争性活性导向蛋白质分析方法——基于同位素标记串联正交酶水解的活性蛋白质分析技术（isotopic Tandem Orthogonal Protease-activity-based Protein Profiling，isoTOP-ABPP）。首先被应用于在全蛋白质组范围内定量分析半胱氨酸的反应活性。

isoTOP-ABPP技术发展：在此基础上，该团队在2013年于《Nature Methods》发表了题为“A chemoproteomic platform to quantitatively map targets of lipid-derived electrophiles”的另一研究。在该研究中，团队利用“竞争性结合”这一概念，通过对比分析小分子化合物与探针作用后标记信号的改变，来鉴定小分子在细胞中与靶蛋白结合的具体半胱氨酸位点。

isoTOP-ABPP技术原理：不同于之前技术中化合物对蛋白质的直接标记，在该研究中，isoTOP-ABPP先将待研究的小分子化合物处理实验组样品，用等量的对照溶剂处理对照组样品。随后在两组中分别加入DBIA/IAA探针进行竞争标记。最后，通过点击化学反应及质谱分析，比较实验组与对照组样品，其中标记信号显著降低的位点即是小分子化合物的潜在结合位点。

isoTOP-ABPP使用的探针

isoTOP-ABPP技术流程原理

|  技术特点

• 无需标记，可用于小分子或中药复方的靶点筛选

• 筛选药物共价结合靶点的同时，还能够定位结合的氨基酸位点

• 定量测定药物对不同靶点的结合情况

• 在活细胞水平筛靶，更具生理相关性

|  isoTOP ABPP的应用场景

1. 筛选小分子化合物的靶点蛋白：小分子化合物与DBIA/IAA探针竞争标记，寻找其在蛋白组中共价结合的靶点蛋白。

2. 筛选复方的靶点蛋白：复方与DBIA/IAA探针竞争标记，实现复方结合靶点的鉴定。

3. 药物结合的氨基酸位点定位：在获得共价靶点的基础上，进一步明确小分子结合的具体半胱氨酸位点。

4. 开发新的共价药物：鉴定药物能够结合的高反应性、高活性的半胱氨酸位点，为理解药物机制和开发新的共价药物提供数据支持。

|  案例分析

案例一：蒲地蓝与黄芩素共价靶向 GAPDH Cys150

急性肺损伤（ALI）以巨噬细胞活化失调与细胞因子释放为特征。研究采用半胱氨酸反应性 ABPP 策略，在巨噬细胞中绘制复方蒲地蓝（Pudilan, PDL）的共价靶点图谱，并通过竞争性 ABPP、CETSA、酶活性测定、生物膜层干涉（BLI）与分子对接验证靶点结合与功能影响。结果显示，3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH） 是蒲地蓝的主要共价靶点，且修饰位点为其催化性半胱氨酸残基 Cys150；进一步研究锁定 黄芩素（baicalein, BC） 是介导这一结合的主要活性成分。

蒲地蓝与黄芩素均可共价结合 GAPDH 的 Cys150 并抑制其酶活性，进而抑制糖酵解通量（即巨噬细胞的 Warburg 效应），促使代谢向氧化磷酸化（OXPHOS）方向转变，并逆转促炎的 M1 型极化，从而缓解急性肺损伤相关的炎症反应。该工作为"复方—活性成分—直接靶点—代谢重编程"提供了一条可验证的机制路径。

案例二：穿心莲内酯共价靶向 Ptges3 Cys58

特发性肺纤维化（IPF）是一种以慢性炎症与成纤维细胞活化为特征的进行性、致死性肺病，现有治疗选择有限。天然二萜内酯穿心莲内酯（andrographolide, AP）具有抗炎与抗纤维化活性，但其直接分子靶点与确切机制此前尚不清晰。为了揭示其作用机制，该研究采用isoTOP-ABPP技术鉴定其共价靶点蛋白。结果显示，穿心莲内酯共价结合于前列腺素 E 合成酶 3（prostaglandin E synthase 3, Ptges3，亦称 p23）的 Cys58 位点。二者结合后，Ptges3 的酶活性受到抑制、前列腺素 E₂生成减少，同时 Ptges3-Hsp90 伴侣复合物被破坏，进而抑制 NF-κB 信号通路；遗传学层面的 Ptges3 敲低可显著削弱穿心莲内酯在体外与体内的抗炎、抗纤维化效应，从因果角度支持 Ptges3 是其功能靶点。

|  参考文献

1. Jiang M, Yang Y, Zhang Y, et al. Covalent targeting GAPDH by Pudilan formula and baicalein suppresses macrophage Warburg effect to alleviate acute lung injury. Phytomedicine. 2026;151:157727. doi:10.1016/j.phymed.2025.157727

2. Zhang Q, Zhang Y, Wang C, et al. Andrographolide attenuates pulmonary fibrosis by covalently targeting Ptges3 and disrupting the Ptges3-Hsp90-NF-κB axis. Journal of Advanced Research, 2026. doi:10.1016/j.jare.2026.05.038）

3. Zhu Y, Zhang Y, Zhang Q, et al. Caffeic Acid Acts as a Potent Senomorphic and Alleviates Inflammation and Lung Fibrosis by Covalently Targeting Annexin A5 Protein in Mice. Exploration (Beijing). 2025;5(6):20240069. Published 2025 Dec 12. doi:10.1002/EXP.20240069 

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