共价结合位点鉴定的核心原理是通过识别小分子修饰所引起的质量变化，并结合串联质谱（MS/MS）精确定位修饰位点。当小分子药物与蛋白中的亲核残基（如半胱氨酸、赖氨酸或N-末端）形成共价键时，修饰会导致目标肽段或蛋白整体分子质量发生特征性偏移。通过高分辨质谱对肽段进行一级质谱检测（MS1），可筛选出与理论肽段质量相差等于小分子残基质量的肽段；进而利用二级质谱（MS/MS）碎片信息直接锁定修饰发生的具体氨基酸残基位点。该方法广泛应用于药物靶点验证、共价抑制剂筛选及作用机制研究。

|  达吉特技术优势

1. 完整蛋白水平预实验结合肽段水平正式实验，实现小分子与蛋白结合，从整体到氨基酸位点的全面解析；

2. 针对蛋白样本进行还原烷基化、切糖等个性化、标准化的前处理，最大程度提高修饰肽段位点的检出率与实验稳定性；

3. 采用高效液相色谱与高分辨质谱联用技术，显著提高复杂样本中修饰肽段的分辨率与检测灵敏度；

4. 提供完整结合位点鉴定的数据结果，包含完整二级谱图、修饰位点标注、关键肽段位点定量值信息等。

|  研究案例

研究案例1：二甲双胍与其靶点蛋白PEN2的共价结合位点鉴定

厦门大学研究团队设计合成光交联二甲双胍小分子探针，利用ABPP技术鉴定出二甲双胍的蛋白靶标PEN2。进一步采用质谱技术鉴定二者的共价结合位点为 Y47 氨基酸残基，这表明二甲双胍能够结合氨基末端的胞质面。本研究首次发现γ-分泌酶亚基PEN2是二甲双胍的直接分子靶点，最终揭示了二甲双胍通过PEN2-ATP6AP1通路发挥降血糖、减少肝脏脂肪和延长寿命的关键机制。

研究案例2：醉茄素A与其靶点蛋白KPNB1的共价结合位点鉴定

四川大学研究团队通过筛选发现天然产物醉茄素A对未分化甲状腺癌（ATC）具有显著抑制作用。采用DARTS、CETSA与MST等技术筛选验证其直接靶点是核转运受体家族成员KPNB1。进一步采用质谱技术鉴定二者间的共价结合位点可能是KPNB1的CYS158和CYS228，结合点突变实验验证，最终证实醉茄素A与KPNB1的CYS158共价结合，揭示了其改善甲状腺癌的分子机制。

|  参考文献

[1]. Ma T, Tian X, Zhang B, et al. Low-dose metformin targets the lysosomal AMPK pathway through PEN2. Nature. 2022;603(7899):159-165. Published 2022 Feb 23.（厦门大学）IF=48.5

[2]. Xing Z, Cai X, He T, et al. VCP's nuclear journey: Initiated by interacting with KPNB1 to repair DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 2025;122(19):e2416045122. Published 2025 May 8.（四川大学）IF=9.1

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