天然产物靶点研究，找到“结合了谁”只是第一步

天然产物与靶蛋白之间的相互作用既可能表现为可逆的非共价结合，也可能通过亲电反应基团与蛋白特定氨基酸残基形成稳定的共价加合物。对于具有潜在共价反应活性的天然产物而言，如果能够进一步明确其与靶蛋白形成共价结合的具体氨基酸位点，不仅可以确认直接作用关系，还能够进一步解析其结合模式与作用机制。

因此，在完成天然产物靶点筛选后，进一步利用LC-MS/MS进行共价结合位点鉴定，可以将研究从“靶点是谁”深入到“究竟结合在哪里”。

共价结合鉴定的核心原理是通过识别修饰所引起的质量变化，并结合串联质谱（MS/MS）精确定位修饰位点。当小分子药物或化学探针与蛋白中的亲核残基（如半胱氨酸、赖氨酸或N-末端）形成共价键时，修饰会导致目标肽段或蛋白整体分子质量发生特征性偏移。LC-MS/MS不仅能够告诉我们“天然产物是否与该靶蛋白共价结合”，还能够进一步回答“天然产物与这个蛋白的哪个氨基酸发生了共价结合”。

本文汇总4项相关研究，一起看看天然产物与靶点的共价结合位点如何展开研究：

案例1：天然产物Auxarconjugatin B共价靶向SCAMP2治疗胶质母细胞瘤

• 天然产物：Auxarconjugatin B（AUX-B）

• 靶蛋白：分泌载体膜蛋白2（SCAMP2）

• 结合位点：赖氨酸Lys130

2026年2月，中国医学科学院药物研究所研究团队在Acta Pharmaceutica Sinica B（IF=14.6）发表题为“Targeting SCAMP2 by a natural product auxarconjugatin B for glioblastoma therapy via restoring aspartate metabolic flux”的研究论文。

研究者首先设计炔基标记的AUX-B探针，并利用ABPP技术筛选其作用靶点为SCAMP2，进一步通过LC-MS/MS鉴定AUX-B与SCAMP2的共价结合位点是Lys130（K130）。深入的机制研究表明，AUX-B与SCAMP2共价结合后，显著破坏SCAMP2与天冬氨酸转运蛋白SLC1A3和SLC25A12的相互作用，导致细胞内天冬氨酸水平下降，从而抑制胶质母细胞瘤增殖。

• 天然产物：去氢木香内酯（DCL）

• 靶蛋白：NOD样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）

• 结合位点：半胱氨酸Cys280

2025年9月，南京中医药大学研究团队在MedComm（IF=14.4）发表题为“Dehydrocostus Lactone Effectively Alleviates Inflammatory Diseases by Covalently and Irreversibly Targeting NLRP3”的研究论文。

研究者首先整合ZINC、TCMSP及内部天然产物库开展虚拟筛选和共价对接，从中筛选出具有潜在NLRP3共价结合能力的天然产物去氢木香内酯DCL。随后通过细胞活性实验发现，DCL可显著抑制NLRP3炎性小体活化及IL-1β释放。进一步利用LC-MS/MS解析DCL修饰的NLRP3肽段，确定其通过Michael加成反应与Cys280形成共价键，并经C280A突变得到验证。机制研究表明，DCL共价修饰NLRP3 Cys280后破坏NLRP3与NEK7的相互作用，进而抑制NLRP3炎性小体激活。

案例3：旋覆花中的内酯类天然产物共价靶向PBK治疗神经炎症

• 天然产物：1-O-acetyl-4R,6S-britannilactone （AB）

• 靶蛋白：PDZ结合激酶（PBK）

• 结合位点：半胱氨酸Cys70

2025年7月，天津中医药大学研究团队在PNAS（IF=9.4）发表题为“Targeting PBK with small-molecule 1-O-acetyl-4R,6S-britannilactone for the treatment of neuroinflammation”的研究论文。

研究者首先利用20K人类蛋白质组芯片筛选AB的潜在作用靶点，鉴定获得PBK，并通过DARTS/CETSA+WB、MST等技术验证二者的直接结合。进一步利用LC-MS/MS鉴定共价结合位点，发现AB通过Cys70与PBK形成共价结合。机制研究表明，AB共价修饰PBK Cys70后，调控PBK/TIPE2信号轴，抑制TIPE2 S3位点磷酸化及泛素化降解，从而发挥抗神经炎症作用。

案例4：醉茄素A共价靶向KPNB1抑制肿瘤生长

• 天然产物：醉茄素A （WA）

• 靶蛋白：核收受蛋白亚基Β-1（KPNB1）

• 结合位点：半胱氨酸CYS158

2025年5月，四川大学研究团队在PNAS（IF=9.4）发表题为“VCP’s nuclear journey: Initiated by interacting with KPNB1 to repair DNA damage”的研究论文。

研究者首先通过DARTS技术从间变性甲状腺癌细胞中筛选出天然产物醉茄内酯A（WA）的潜在作用靶点KPNB1，并结合CETSA、DARTS和MST等技术进一步验证二者的直接结合。随后通过片段定位与LC-MS/MS质谱分析发现KPNB1的Cys158和Cys228可能为WA的共价结合位点，并经突变实验进一步确认Cys158是关键结合残基。机制研究表明，WA通过与KPNB1 Cys158形成共价结合，破坏KPNB1与VCP的相互作用，抑制VCP核转位及DNA损伤修复，进而发挥抗肿瘤作用。

天然产物靶点研究并不应止步于“筛选验证靶蛋白”。对于具有潜在共价反应活性的天然产物，进一步明确其与靶蛋白形成共价结合的具体氨基酸位点，可以为直接靶点关系提供更深入的分子证据，同时帮助解析天然产物的结合模式、关键结构基础及作用机制。

因此，一条更加完整的研究证据链可以概括为：

其中，LC-MS/MS共价结合位点鉴定正是连接“靶点发现”和“机制解析”的重要环节。对于含有亲电反应基团、具有潜在共价作用特征的天然产物，与其只回答“它结合了谁”，不妨进一步回答“它究竟结合在哪里”。

靶点筛选不是终点，结合位点解析让药靶研究更进一步。针对具有潜在共价结合特征的天然产物，达吉特可通过LC-MS/MS开展共价结合位点鉴定，定位天然产物修饰的关键氨基酸残基，为“靶点鉴定—结合位点—作用机制”研究提供完整的技术支持。