灰霉菌（Botrytis cinerea）是一种坏死性植物病原真菌，具有广泛的寄主范围，对农作物造成巨大经济损失。目前市场上约85%的杀菌剂针对单一酶靶点，这导致了抗药性的频繁出现，严重威胁农业安全生产。因此，开发作用于新靶点、低毒性的新型杀菌剂迫在眉睫。

近日，兰州大学刘映前教授团队在《Science Advances》发表了题为“Indoloquinoline alkaloid neocryptolepine derivative inhibits Botrytis cinerea by targeting thiamine thiazole synthase”的研究论文。研究发现新白叶藤碱类生物碱Z24具有显著抗菌活性。进一步通过药物亲和靶向稳定性（DARTS+MS）以及SPR、CETSA+WB等技术筛选并验证了Z24的直接作用靶点是Bcthi4。结合转录组学和代谢组学结果，化合物Z24通过靶向Bcthi4，阻断真菌的硫胺素生物合成途径，进而引发真菌内广泛的代谢失调，最终抑制真菌生长。

研究者利用6种不同植物病原真菌进行实验，发现衍生物Z24处理显著抑制了真菌孢子萌发率，破坏菌丝细胞结构，具有显著的抗真菌活性（图1A-C）。进一步，研究者为了阐明化合物Z24的抗菌机制，采用药物亲和靶向稳定性（DARTS+MS）在灰霉菌中进行靶点筛选，结果共有367种蛋白被鉴定为潜在靶标（图1D）。其中，排名靠前的硫胺素噻唑合成酶（Bcthi4）作为硫胺素生物合成途径中的关键酶引起了研究者的注意。通过SPR、DARTS/CETSA+WB以及分子对接实验进行验证，结果证实，Bcthi4是化合物Z24的直接作用靶点（图1E-F）。并且功能性实验结果证实，化合物Z24能够显著抑制灰霉菌中靶向Bcthi4的酶活性，证明其抗菌活性与该过程的调控作用密不可分。

图1  化合物Z24的抗菌靶点是硫胺素噻唑合成酶（Bcthi4）

为了探究Z24靶向Bcthi4发挥抗菌作用的分子机制，研究者进行了转录组学分析。结果显示，化合物Z24处理后的灰霉菌中，DEGs显著富集于核糖体功能、氨酰基-tRNA合成、氨基酸生物合成以及多种代谢相关途径中（图1A-B）。硫胺素作为细胞代谢中必不可少的辅酶，在糖代谢和能量产生等多种生化过程中发挥着至关重要的作用。结合前序实验结果，化合物Z24通过靶向Bcthi4使菌中的硫胺素合成受到抑制，细胞中的核糖体基因与氨酰基-tRNA合成酶表达的显著增加，正是对硫胺素缺乏的生物学反应。此外，转录组数据中共检测到70420个剪接位点，鉴定处4290个可变剪接事件（图1C）。这些差异可变剪接基因显著富集于硫胺素代谢通路，证明灰霉菌可能通过可变剪接增加菌中蛋白质组的复杂性，启动了一系列补偿性防御反应，来应对化合物Z24对于真菌遗传代谢的胁迫。

图2  化合物Z24处理后灰霉菌的转录组变化

基于以上数据结果，进一步探究化合物Z24在灰霉菌中的调控作用。结果显示，真菌为了应对化合物的杀菌胁迫，通过上调部分关键酶基因（如Bcthi4）表达进行补偿，然而化合物Z24通过特异性靶向阻断硫胺素生物合成，酶活性严重受损，导致底物/中间产物累积，从而干扰真菌能量代谢和生长，使真菌这种“自杀式”补偿机制仍然无法弥补不足（图3A-C）。随后，研究者进行功能性实验验证化合物24的作用机制。结果显示，Z24的抑菌作用能够被外源补充的硫胺素显著逆转，而对照组别则不受影响（图3D）。证明了化合物Z24是通过特异性抑制灰霉菌体内的硫胺素生物合成途径来发挥功能的。

图3  化合物Z24特异性抑制硫胺素生物合成途径发挥杀菌作用

研究者为了全面了解化合物Z24的抗菌机制，并验证其对硫胺素代谢途径的影响，研究者进行了代谢组学分析。结果显示，化合物Z24引起了灰霉菌代谢物全局性且显著性的变化，包括氨基酸代谢途径和多种氨基酸及其前体/中间体的丰度变化。而这些变化与Z24抑制硫胺素合成的机制直接相关，正是由于Z24对于硫胺素活性形式（TPP）的抑制作用，导致依赖于TPP的酶活性受损，进而引发广泛的代谢紊乱，这种代谢网络的崩溃是Z24抑制真菌生长的深层原因。最后，研究者对Z24的安全性在体内外水平上进行了系统性评估。结果显示，Z24对哺乳动物细胞和动物的毒性极低，具有优良的安全性。此外，在番茄和黄瓜盆栽模型中的验证结果显示，Z24的杀菌效果显著，并且对种子发芽无植物毒性。以上结果证明，化合物Z24是一种极具开发潜力的新型、安全、高效的抗真菌候选药物。

图4  化合物Z24抗菌作用的代谢组学分析及安全性评价

总结与讨论

本研究发现了首个靶向Bcthi4的真菌抑制剂，并阐明了该杀菌剂的全新作用机制。研究者将靶点筛选技术与多组学技术有机结合，在发现化合物的下游靶点后，寻找组学结果中与其关联的差异基因和作用途径，再与真菌内的独特效应机制进行综合分析，最终确定了化合物Z24发挥杀菌作用的分子机制。此外，结合体内外功能性实验，证实了化合物Z24优异的杀菌活性和安全性，具备成为新一代杀菌剂的潜力。

本文所使用的靶点筛选技术DARTS技术最近越来越火。该技术具有普遍适用性，除了用于医学相关药理研究之外，在植物、昆虫、微生物的靶点发现中也能够获得较为准确的结果，而且还可用于中药复方等混合物的靶点筛选研究。

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相关文献

Zhao WB, An JX, Jin YR, et al.Indoloquinoline alkaloid neocryptolepine derivative inhibits Botrytis cinerea by targeting thiamine thiazole synthase.Sci Adv. 2025;11(11):eadq5329. doi:10.1126/sciadv.adq5329