肝星状细胞（HSC）是肝脏中一种具有特殊功能的非实质细胞，其活化状态（即活化的肝星状细胞，aHSC）在肝脏疾病（尤其是肝纤维化）的发生发展中扮演核心角色。有研究表明，清除肝脏中aHSC能够有助于控制肝纤维化进展，而在研究者之前的工作中发现，我国长期用于肝病治疗的柴胡中的活性成分柴胡皂苷b1（Ssb1）具有诱导aHSC凋亡和抗肝纤维化的潜在作用，但其发挥作用的分子机制尚不清楚。

浙江中医药大学曹岗、彭梦云研究团队在《Exploration》（IF=22.5）在线发表题为“Saikosaponin b1 Attenuates Liver Fibrosis by Blocking STAT3/Gli1 Interaction and Inducing Gli1 Degradation”的研究论文，为肝纤维化的临床治疗提供了新的策略。本研究通过20K人类蛋白组芯片发现了柴胡皂苷b1的直接靶点STAT3，深入机制研究表明，柴胡皂苷b1通过靶向抑制STAT3的转录活性，调控Hedgehog（Hh）信号通路中STAT3/Gli1/Bcl2轴，最终诱导aHSC凋亡。

研究者发现柴胡皂苷b1（Ssb1）能够通过诱导活化的肝星状细胞（aHSC）凋亡来改善模型小鼠肝纤维化（图1A），进一步的转录组学分析显示，Ssb1处理后的差异表达基因显著富集于ECM-受体相互作用途径（图1B）。由此，研究者猜测Ssb1可能调控HSC功能并减少ECM累积。体外功能实验结果显示，Ssb1能够显著抑制HSC活化生物标志物（如α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白等）的mRNA水平并有效抑制HSC活化和相关基质蛋白水平（图1C-D）。

图1  柴胡皂苷b1通过抑制HSC的激活来抑制肝纤维化

为了鉴定Ssb1发挥作用的靶点蛋白，研究者设计并合成了生物素修饰的Ssb1探针（Bio-Ssb1），在确认该探针仍具有原本的功能活性后，利用20K人类蛋白组芯片筛选其直接靶点（图2A）。对筛选到的潜在结合蛋白进行KEGG富集分析，结果显示，Ssb1结合蛋白优先富集于HIF-1信号通路中（图2B），且该通路中包含的14种蛋白中STAT3与Ssb1的结合最为显著（图2C）。研究者推测，Ssb1可能通过靶向STAT3来调节HIF-1α表达（图D），随后的qPCR和WB验证结果证实Ssb1能够显著抑制STAT3的磷酸化和HIF-1α表达（图E-F）。（达吉特为该研究提供了小分子生物素修饰和20K人类蛋白组芯片筛靶服务）

图2  20K人类蛋白组芯片筛选柴胡皂苷b1的直接靶点

基于以上结果，研究者深入探究Ssb1与STAT3的相互作用关系。20K芯片检测中竞争组结果显示，未标记的原型Ssb1能够有效阻断Bio-Ssb1与STAT 3的结合（图3A）。Pull down/CETSA以及SPR实验结果也进一步证实了Ssb1与STAT3的直接结合（图3B-D）。此外，研究者利用LC-MS/MS结合分子动力学模拟等技术鉴定二者结合位点，发现STAT3的S319残基是Ssb1的主要结合位点（图3E-F）。（达吉特可提供Pull down、CETSA、SPR、共价结合位点鉴定技术服务）

图3  STAT3是柴胡皂苷b1的直接靶点

为阐明Ssb1靶向STAT3在肝纤维化进展中的作用，研究者鉴定了肝癌患者癌组织中STAT3的表达情况。结果显示，肝纤维化中STAT3的705位酪氨酸残基（Tyr705）磷酸化显著增加，证明其被激活。随后，研究者通过STAT3抑制剂及敲除过表达实验来验证阻断STAT3激活对肝纤维化和aHSC的影响，结果显示STAT3在肝HSC中的活化与肝纤维化的发展呈正相关趋势（图4A-B）。

鉴于STAT3作为重要的转录因子，Tyr705的磷酸化正是激活STAT3的“关键开关”，随后诱导STAT3的二聚化和核转位，并上调STAT3的转录活性。研究者进一步确定Ssb1是否靶向STAT3磷酸化而发挥作用，结果显示，Ssb1与STAT3的直接结合有效阻断了HSC中STAT3的Tyr705磷酸化、二聚化和核转位，抑制其激活，从而减轻肝纤维化（图4C-D）。

图4  柴胡皂苷b1通过抑制STAT3活化而减轻肝纤维化

研究者进一步阐明Ssb1靶向STAT3抑制HSC活化的深入机制，RNA seq结合功能性实验结果显示，Hh信号通路被显著富集，且该通路的异常激活是aHSC持续活化和肝纤维化进展的关键诱因，而Ssb1能够显著抑制Hh信号（图5A-B）。进一步的实验结果显示，该过程的内在机制是STAT3与Hh信号通路的关键转录因子Gli1发生相互作用，而Ssb1直接靶向STAT3并降低其转录活性（图5C），同时，Ssb1还破坏了STAT3与Gli1的相互作用，并通过泛素-蛋白酶体系统促进Gli1降解，Gli1的功能缺失则导致其下游发挥抗凋亡作用的靶基因（Bcl2）表达减少，从而促进aHSC凋亡，最终减轻肝纤维化进展（图5D-E）。最后，在肝纤维化动物模型中的实验结果证实，Ssb1通过靶向STAT3同时调控STAT3-Gli1相互作用来减轻肝纤维化（图5F）。

图5  柴胡皂苷b1靶向STAT3-Gli1，抑制Hh信号，减轻肝纤维化

总结与讨论

小分子结合蛋白靶点筛选工作是揭开中药来源天然产物及中药本身机制的关键环节，目前常规的研究策略分为标记法（Pulldown、ABPP、20K人类蛋白组芯片）和非标记法（DARTS、CETSA、Lip-MS）两大体系。由于标记策略对于低丰度靶点具有富集作用，一直是高水平杂志青睐的技术选择。然而，基于活细胞的靶点筛选工作会受到蛋白复合物的干扰。达吉特推出的20K人类蛋白组芯片筛靶策略完美解决了非特异结合靶点的问题（芯片上的2万种蛋白质各自独立），20K芯片筛到的所有靶点都是直接靶点，大大降低了筛靶后续的靶点挑选和验证的工作量和经费投入，正在成为小分子靶点与中药物质基础研究炙手可热的技术选择。

目前，达吉特所服务的科研团队基于20K人类蛋白组芯片的筛靶策略已经发表了大量的高水平研究工作，举例如下：

[1]. Shao M, Zhang X, Sun J, et al. Saikosaponin b1 Attenuates Liver Fibrosis by Blocking STAT3/Gli1 Interaction and Inducing Gli1 Degradation. Exploration. 2766-8509. （浙江中医药大学）IF=22.5

[2]. Xuan C, Chen D, Zhang SN et al. Isoquercitrin Alleviates Diabetic Nephropathy by Inhibiting STAT3 Phosphorylation and Dimerization. Adv Sci (Weinh). 2025 Apr 4:e2414587. Published 2025 Apr 4. （中国人民解放军总医院）IF=14.3

[3]. Hu M, Xu Y, Wang Y, et al. Gut microbial-derived N-acetylmuramic acid alleviates colorectal cancer via the AKT1 pathway. Gut. Published 2025 February 27（南方医科大学珠江医院）IF=23.1

[4]. Chen L, Wu B, Mo L, et al. High-content screening identifies ganoderic acid A as a senotherapeutic to prevent cellular senescence and extend healthspan in preclinical models. Nat Commun. 2025;16(1):2878. Published 2025 Mar 24.（华中科技大学同济医学院）IF=14.7

[5]. Chen YJ, Shi RC, Xiang YC, et al. Malate initiates a proton-sensing pathway essential for pH regulation of inflammation. STTT. 2024;9(1):367. Published 2024 Dec 30. （陆军军医大学&重庆医科大学）IF=40.8

[6]. Li D, Wei R, Zhang X, et al. Gut commensal metabolite rhamnose promotes macrophages phagocytosis by activating SLC12A4 and protects against sepsis in mice. Acta Pharm Sin B. 2024;14(7):3068-3085. Published 2024 Mar 22.（南方医科大学）IF=14.7
[7]. Deng Y, Zeng L, Liu H, et al. Silibinin attenuates ferroptosis in acute kidney injury by targeting FTH1. Redox Biol. 2024 Nov;77:103360.  Published 2024 Sep 20.（哈尔滨医科大学附属第二医院）IF=14.3

[8]. Cui J, Chen Y, Yang Q, et al. Protosappanin A Protects DOX-Induced Myocardial Injury and Cardiac Dysfunction by Targeting ACSL4/FTH1 Axis-Dependent Ferroptosis. Adv Sci (Weinh). 2024 Sep;11(34):e2310227. Published 2024 Jul 10. （哈尔滨医科大学附属第二医院）IF=14.3

[9]. Zheng Y, Zhao L, Xiong Z, et al. Ursolic acid targets secreted phosphoprotein 1 to regulate Th17 cells against metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease. Clin Mol Hepatol. 2024 Jul;30(3):449-467. Published 2024 Apr 16. （上海中医药大学联合广州中医药大学）IF=14.0

[10]. Liu F, He H, Yang W, et al. Novel energy optimizer, meldonium, rapidly restores acute hypobaric hypoxia-induced brain injury by targeting phosphoglycerate kinase 1. Cell Commun Signal. 2024;22(1):383. Published 2024 Jul 29. （北京药理毒理研究所）IF=8.2

[12]. Zhong J, He X, Gao X, et al. Hyodeoxycholic acid ameliorates nonalcoholic fatty liver disease by inhibiting RAN-mediated PPARα nucleus-cytoplasm shuttling. Nat Commun. 2023 Sep 6;14(1):5451. Published 2023 Sep 06.（上海中医药大学）IF=14.7

[13]. Zhao T, Zeng J, Xu Y, et al. Chitinase-3 like-protein-1 promotes glioma progression via the NF-κB signaling pathway and tumor microenvironment reprogramming. Theranostics. 2022 Oct 3;12(16):6989-7008. Published 2022 Oct 3. （广州医科大学）IF=14.7

[14]. Zhou WJ, Yang HL, Mei J, et al. Fructose-1,6-bisphosphate prevents pregnancy loss by inducing decidual COX-2+ macrophage differentiation. Sci Adv. 2022;8(8):eabj2488. Published 2022 Feb 23.（复旦大学附属妇产科医院）IF=11.7

[15]. Wang G, Li X, Li N, et al. Icariin alleviates uveitis by targeting peroxiredoxin 3 to modulate retinal microglia M1/M2 phenotypic polarization. Redox Biol. 2022;52:102297. Published 2022 Mar 18.（重庆医科大学附属第一医院）IF=10.7
[16]. Gu Y, Chen Y, Wei L, et al. ABHD5 inhibits YAP-induced c-Met overexpression and colon cancer cell stemness via suppressing YAP methylation. Nat Commun. 2023 Apr 4;14(1):1875. Published 2021 Dec 18.（第三军医大学）IF=14.7

[17]. Zhang P, Tao W, Lu C, et al. Bruceine A induces cell growth inhibition and apoptosis through PFKFB4/GSK3β signaling in pancreatic cancer. Pharmacol Res. 2021;169:105658. Published 2021 May 14.（南京中医药大学）IF=9.1

[18]. Ye S, Luo W, Khan ZA, et al. Celastrol Attenuates Angiotensin II-Induced Cardiac Remodeling by Targeting STAT3. Circ Res. 2020;126(8):1007-1023. Published 2020 Feb 26.（温州医科大学）IF=16.5

[19]. Chen X, Zhao Y, Luo W, et al. Celastrol induces ROS-mediated apoptosis via directly targeting peroxiredoxin-2 in gastric cancer cells. Theranostics. 2020;10(22):10290-10308. Published 2020 Aug 15.（温州医科大学）IF=14.2

[20]. Shen SM, Ji Y, Zhang C, et al. Nuclear PTEN safeguards pre-mRNA splicing to link Golgi apparatus for its tumor suppressive role. Nat Commun. 2018;9(1):2392. Published 2018 Jun 19.（上海交通大学）IF=14.7

达吉特针对中药及小分子药物研究，建立了一套完整的技术服务体系：

1）中药/复方的有效成分高标准鉴定

2）空间药物分布与空间药代动力学

3）小分子化合物批量标记（生物素/炔基/荧光）

4）小分子钓靶（标记法）：20K人类蛋白组芯片/ ABPP

5）小分子钓靶（非标记法）：DARTS /Lip-MS/ CETSA

6）膜蛋白靶点筛选技术：SPIDER / MPA/GPCR膜蛋白芯片

7）药物调控通路筛选：磷酸化抗体芯片/磷酸化蛋白组

8）SPR表面等离子共振（分子动力学）

9) 药-靶结合位点分析（高分辨质谱/分子对接）

10) PET-CT与药物分布小动物活体成像

11）虚拟筛选、天然产物化合物库筛选