小分子筛选下游靶点蛋白是药物发现、疾病机制研究以及生物学功能探究中的关键环节。小分子药物结合靶点蛋白的发现，不仅能帮助理解疾病的分子机制，也能指导药物的设计与优化，从而提高药效、减少副作用，并推动精准医疗的发展。达吉特针对此提供了两类不同的靶点筛选方案，方案一：基于修饰的策略，引入标记基团，提高筛选效率，便于后续分析，适用于可以进行生物素或炔基标记的小分子；方案二：非修饰策略，适用于不能够进行化学修饰的小分子，保持小分子原貌，技术难度较低，直接反应小分子与靶点的相互作用。从小分子标记到小分子靶点筛选再到小分子靶点蛋白的验证，达吉特具备全链条服务体系，帮助研究人员在多个阶段有效筛选和验证潜在的药物靶点。

方案一：基于修饰的策略

No.1 20K人类蛋白组芯片

芯片上有超过2万种人类全长蛋白质，覆盖81%的人类基因组ORF区，是目前世界上通量最高的蛋白质芯片。将带有生物素标记的小分子与20K芯片共同孵育，再引入带有CY3或CY5荧光的链霉亲和素，通过检测芯片上的荧光信号，即可确定小分子的直接结合靶蛋白。20K芯片不仅能够筛选出与小分子直接结合的靶点蛋白，还能解决传统方法中由于蛋白丰度低而难以捕捉的药-靶结合问题，更因其具备丰富的蛋白种类，单次实验即可产出多项科研成果，具有极高性价比。

芯片优势

• 筛选直接结合的靶点蛋白，假阳性率较低

• 无需克隆构建、细胞培养和转染实验

• 芯片覆盖多种蛋白类型，结合蛋白范围更广，性价比较高

• 采用酵母表达纯化，蛋白丰度高，可检测到微弱蛋白互作现象

经典案例：异槲皮苷靶向调控STAT3缓解糖尿病肾病

中国人民解放军总医院（301医院）陈香美院士团队在《Advanced Science》发表了题为“Isoquercitrin Alleviates Diabetic Nephropathy by Inhibiting STAT3 Phosphorylation and Dimerization”的研究论文。研究首次揭示了天然产物异槲皮苷对糖尿病肾病的潜在治疗作用。采用HuProt™ 20K人类蛋白组芯片筛选其直接靶点，再通过靶点功能与调控通路的富集分析，层层递进最终锁定关键靶点。深入的机制研究证实，异槲皮苷靶向并阻碍内皮细胞和肾小管上皮细胞中STAT 3的磷酸化和二聚化，抑制其转录活性，从而发挥肾保护作用。

No.2 ABPP基于炔基标记的点击化学技术

ABPP（Activity-Based Protein Profiling）是在点击化学和LC-MS质谱基础上发展起来的小分子化合物靶点蛋白的筛选技术。将小分子进行炔基标记后处理细胞，通过简便高效的点击化学反应，将结合上靶点蛋白的炔基小分子连接到带有叠氮的磁珠上，通过磁珠离心获取小分子靶向结合的靶点蛋白。进一步，通过LC-MS分析出小分子的潜在靶点蛋白。

特点优势

• 炔基修饰对小分子的活性和结构影响小，几乎不干扰小分子原本的生物活性

• 炔基标记的小分子可在活细胞水平上进行靶点筛选

• 研究方向明确，筛选到的是与研究方向相关的靶点蛋白

• 拥有完整的小分子炔基标记体系

经典案例：光亲和ABPP鉴定二甲双胍的互作靶点

2022年2月，厦门大学生命科学学院林圣彩院士团队在顶级期刊《Nature》上发表了题为“Low-dose metformin targets the lysosomal AMPK pathway through PEN2”的研究文章。利用光亲和ABPP技术鉴定治疗2型糖尿病的一线药物——二甲双胍的互作靶蛋白，最终确定二甲双胍直接靶向PEN2，随后介导AMPK信号通路的激活，从而影响细胞中的代谢调节和相关疾病。

No.3 Pull down+MS技术

Pull down技术是一种有效的筛选药物与潜在靶蛋白之间相互作用的体外技术。利用生物分子之间的亲和力原理，将生物素标记的小分子药物作为“诱饵”固定玉链霉亲和素的磁珠，再从细胞裂解液中“钓取”并富集与之特异性结合的靶点蛋白，随后通过质谱进行药物结合靶蛋白鉴定。

特点优势

• 基于亲和捕获策略，适用于多类型小分子靶点的富集筛选

• 在靶细胞/靶组织中进行筛选，靶点的细胞/组织特异性强

• 高效富集结合蛋白，获得较全面的候选靶点谱

经典案例：绿原酸靶向RAC1缓解系膜增生性肾小球肾炎

中国人民解放军总医院（301医院）陈香美院士团队在《Acta Pharmaceutica Sinica B》发表题为“Direct pharmacological targeting of RAC1 by chlorogenic acid: A novel therapeutic approach for mesangial proliferative glomerulonephritis”研究成果。研究发现，绿原酸能够直接结合小GTP酶RAC1，抑制RAC1-AKT-THBS1-CD36信号轴活化，从而抑制系膜细胞异常增殖并减轻炎症反应，为MsPGN治疗提供了新的分子机制依据。

No.4 SPIDER基于邻近标记技术的膜蛋白靶点筛选技术

SPIDER技术的原理基于结核分枝杆菌类泛素蛋白酶体系统中底物Pup分子在体外能够招募PafA连接酶发挥邻近标记作用。将小分子进行生物素标记后处理活细胞，当小分子与靶蛋白（Target）发生相互作用时，会同时与偶联了生物素的SAm-PupE靠近。在PafA酶的催化作用下，PupE的C末端会与Target蛋白表面的赖氨酸残基共价相连，形成类泛素连接反应，进一步，通过LC-MS分析出小分子的潜在靶点蛋白。该过程将小分子与蛋白质之间的非共价结合相互作用转换为SAm-PupE与靶蛋白的共价连接，从而能够稳定地用于后续靶蛋白的富集、鉴定和分析。

特点优势

• 在活细胞水平上进行靶点筛选，能够保证膜蛋白的活性

• 将小分子与互作蛋白转为共价结合，形成类泛素化连接反应

• 严苛洗脱条件降低非特异性干扰

经典案例：SPIDER筛选SARS-CoV-2S1蛋⽩受体结合区RBD的靶点蛋白

上海交通大学首次利用SPIDER技术检测了SARS-CoV-2S1蛋⽩受体结合区RBD的靶蛋白，同时进行了毒性测试，证明了整个类泛素反应的无毒害性。将SPIDER实验筛选结果与BioGRID数据库相比较取交集，筛选到SARS-CoV-2S1蛋⽩的膜上受体蛋白ACE2，后续通过体内与体外实验证明了二者之间的直接作用关系。

方案二：基于非修饰的策略

No1. DARTS药物亲和反应靶向稳定性技术

药物亲和反应靶向稳定性技术（Drug Affinity Responsive Target Stability，DARTS）是由美国University of California科研团队于2009年提出的。该方法操作简便，可适用于大多数小分子化合物。DARTS技术是基于蛋白的酶解稳定原理，即小分子和靶点蛋白结合后增强靶点蛋白的酶解稳定性。在正常情况下，靶点蛋白容易被广谱的蛋白酶水解成多个肽段。然而，当小分子化合物与靶点蛋白结合后，这种结合作用会稳定靶点蛋白的结构，使其更难被蛋白酶水解。比对加药组与未加药组蛋白酶处理后的蛋白残留情况，最后通过质谱鉴定到小分子的潜在靶点蛋白。

特点优势

• 小分子无需修饰，其构象与活性不产生影响

• 实验原理简单，服务周期短

• 每组3重复，排除个体差异

• 不适于在自然条件下抵抗蛋白质水解的蛋白质或蛋白质结构域

经典案例：外泌体+DARTS发现人参皂苷Rb1对结直肠癌的治疗作用

上海中医药大学曙光医院联合了药物靶点和外泌体机制两大研究热点，发现携带circ-0034880的外泌体可以促进结直肠癌的肝转移，随后筛选到了能够显著抑制该环状RNA表达的中药活性成分人参皂苷Rb1。进一步采用DARTS技术鉴定到了人参皂苷Rb1的作用靶点是与环状RNA生物发生相关的蛋白QKI。通过CETSA和SPR方法验证了二者间的相互作用。最后体内功能实验证明了Rb1预处理的肿瘤细胞来源的外泌体失去了促进癌症肝转移的作用。

 No.2 LiP-MS限制性酶解-质谱分析技术

限制性酶解-质谱分析技术LiP-MS (Limited proteolysis-coupled mass spectrometry)是一种基于有限蛋白酶切的化合物靶点筛选技术，其独特之处在于无需对化合物进行修饰即可实现对特定化合物结合肽段进行筛选。小分子与蛋白质相互作用后，利用两种蛋白酶交叉切割，最后利用质谱技术分析酶解的多肽产物，通过数据分析比对两种酶作用后产生的多肽及位点的不同，鉴定出能够与小分子结合的特定肽段，从而确定小分子结合的靶点蛋白。

特点优势

• 无需对小分子进行修饰，避免了因修饰可能导致的小分子活性改变，服务周期短

• 能够筛选到小分子与靶点蛋白结合的肽段，可进行个性化数据分析

• 实验设置每组3重复，排除个体差异

• 更适用于代谢产物及小分子量化合物的靶点筛选研究

经典案例：LiP-MS技术绘制代谢物-蛋白相互作用图谱

苏黎世联邦理工学院2018年发表在Cell上的文章首次利用LiP-MS技术系统的绘制了代谢物的蛋白结合谱，鉴定出三羧酸循环中大多数代谢物的靶点蛋白。在天然细胞基质中直接进行的代谢物-蛋白质相互作用和结合位点的系统分析，并确定了二者结合后靶点蛋白整体构象发生变化的的原因。

No.3 CETSA细胞热转移技术

细胞热转移技术（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是2013年由瑞典Karolinska研究所团队研发的一项实验技术。该技术基于蛋白的热稳定性原理，即小分子与靶点蛋白结合后会增强靶点蛋白的热稳定性。随着温度的升高，部分蛋白会逐渐降解。相同温度下，结合了药物的蛋白质具有更高的热稳定性，相比未结合药物的蛋白质，未降解蛋白的量会提高，同时该复合蛋白的热熔曲线发生改变，进一步通过质谱鉴定到小分子的潜在靶点蛋白。

特点优势

• 小分子无需修饰，其构象与活性不产生影响

• 实验原理简单，服务周期短

• 需要提供靶细胞，研究方向明确

• 不适用于在自然条件下耐温的蛋白质

经典案例：CETSA+MS助力揭示天然产物缓解神经性疼痛的新机制

2023年中国医学科学院药物研究所庾石山团队利用CETSA+MS（TPP)技术，鉴定到木藜芦烷毒素Rho的主要靶点蛋白N-乙基马来酰亚胺敏感融合蛋白 (NSF) ，通过ITC与分子对接实验进一步验证了二者的的直接作用关系。结果表明Rho通过抑制NSF介导的Cav2.2钙通道跨膜运输缓解神经性疼痛。

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